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WB抗體試驗說明
日期：2024-09-20 07:43
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摘要：
WB抗體檢測某一個基因的表達(dá)產(chǎn)物或者要比較表達(dá)產(chǎn)物量的相對變化，先選方法是western blot。而Western Blot試驗中比較這些的前提條件是等量的細(xì)胞上樣，這樣才有比較的基礎(chǔ)。而人為的操作會產(chǎn)生一定的誤差，這些誤差可以通過測定每個樣品中實際轉(zhuǎn)到膜上的內(nèi)參來校正。因此選擇一個合適的內(nèi)參抗體來校正上樣誤差是非常重要的。所以嚴(yán)謹(jǐn)?shù)腤estern Blot實驗設(shè)計中需要有良好的參照體系，后續(xù)的實驗結(jié)果分析才具有說服性。
在Western Bloting實驗中，可能內(nèi)參即是內(nèi)部參照(Internal Control)，對于哺乳動物細(xì)胞表達(dá)來說一般是指由管家基因編碼表達(dá)的蛋白(Housekeeping Proteins)，它們在各組織和細(xì)胞中的表達(dá)相對恒定，在檢測蛋白的表達(dá)水平變化時常用它來做參照物。
在Western Blotting 中使用內(nèi)參其實就是在WB過程中的另外用內(nèi)參對應(yīng)的抗體檢測內(nèi)參，這樣在檢測目的產(chǎn)物的同時可以檢測內(nèi)參的表達(dá)，由于內(nèi)參在各組織和細(xì)胞中的表達(dá)相對恒定，借助檢測每個樣品內(nèi)參的量就可以用于校正上樣誤差，這樣半定量的結(jié)果才更為可信。此外使用內(nèi)參可以作為空白對照，檢測蛋白轉(zhuǎn)膜情況是否完全、整個Western Blot顯色或者發(fā)光體系是否正常。
常用的細(xì)胞總蛋白質(zhì)內(nèi)參有GAPDH、beta-actin和beta-tubulin等。對于一些植物的樣本，則需要特別的植物Actin蛋白作為內(nèi)參，同樣的，如果提取的樣本是細(xì)胞核蛋白，那么PCNA或者組蛋白H3都是被經(jīng)常使用的，而針對一些研究線粒體的客戶，那么Cox IV則被較多的文獻(xiàn)引用作為線粒體總蛋白的內(nèi)部參考。